本发明涉及一种沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,该方法利用齿肋赤藓转录组数据库,选取15个内参候选基因,以15个内参基因为模板设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物,选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的齿肋赤藓配子体为实验材料进行荧光定量PCR实验,运用geNorm,NormFinder和Refinder软件进行荧光定量数据的分析,从而筛选出齿肋赤藓开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合,最稳定的内参分子是CDPK和α-TUB2。用本发明所述方法可避免不同非生物胁迫下的齿肋赤藓配子体材料在RNA质量,产量及反转录效率等上的存在的误差,能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化,提高了该种基因定量研究的准确性和可靠性。
1.一种沙漠藓类齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,其特征在于按下列步骤进行:a、利用齿肋赤藓转录组测序数据,挑选15个齿肋赤藓内参候选基因,并以挑选的15个齿肋赤藓序列为基础设计了15对实时荧光定量PCR的内参基因引物,其中15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为:序列1齿肋赤藓SyntrichiacaninervisActin核苷酸序列ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACAGAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGGCGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGAGGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACCGGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCATTCTGCGGCTGGACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGGCCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACACAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGCGGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTACAACTCGATCATGAAGTGTGACGTCGATATCCGTAAAGACCTGTACGGAAACATCGTGTTGTCTGGAGGATCGACCATGTTCCCGGGCATCGCCGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCGCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCGCCGCCGGAGAGGAAGTACAGTGTCTGGATCGGAGGATCCATCTTGGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTGCGAAGAGCGAGTACGATGAGTCCGGTCCATCGATTGTGCACAGGAAGTGCTTT实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:TCGTGTTGTCTGGAGGATCG反向引物:TACTCGCTCTTCGCAATCCA序列2齿肋赤藓Syntrichiacaninervis肌动蛋白相关蛋白核苷酸序列GTGAGCCATGAGTTGAAACTAATAAATTGGAAAGAAAAACAAGCTCAGAAAATGAGCGTACATCGTTGAGACGGTCAGACGAACCATTATCTACGGACATGCGTATTGCGTTGTTCAGGAATGTTCTTTGCGTGGAACTCGGTGTCGGTAACTGGAAGATGTTGACGCAGTTGCTGCTGTTACCTTGCTGACCAAGTTTAGTCCAACATGGCATTGTACCAAAAAGCTTGCGCCTGGAGGGTGTTGGAGTCCCTGTACTTTCGGCCGCTGCCCACCATGACCATACCGTCCAACCAGTCCTCGTACTGCACCCATGAGTCGCGTCCGAAGTCCAAGACGGCGAGAACCGCGCCACCTTTCCACATGATATTCATTGGAGCCATTCGATTTTGAAGAACCTCCACAGTGTCCACAGCTTCGTCCACAGGTATGGCGTGCAGAACCCTCTCCTCAACAGCATCAACCAGGCCTTTCGTTAACCCAACGCCGCCAACCAGCTGAATACTCGCGAACAGCTTCTTCTGAAGATCCACGCGACCTAACGACAGGATACTTTTCACAATAGCTTGTGCAAGGCCACTTGAAGCTTCTTCCACCTCTTTCTTCCCTTTATCTTCAAAGTCGTACGGATCGGAATCATTGTTAATAGAGTTTCCATTAACACTTCCGTTGGTTCCTCCTGTTTCATTTGTCTCAATACGTCGGACAGCTTCAGAAAATGAATCTTCCGCAGTATCTTCATAATCTACGTGATACCAGGGTCGAGGAAGAATCGAATACTCTTCCAGTGCAAGTAGCGAAGGGTAAAATAGTCCCATGGGTGGAATGTTGATGGAAGATAATACGACTGTATATACTCGAGTTGGCTCGCCTGCCATGCGGCACTTGATATCAACCGTCGTGTGTTGCTCACCTTCCAGAAGCACGCAGTGGGTCTCCTTCAGTTTCTCAAGAGTCAAAAAGTCCAACGGATCACGCAAAGGATCAGTATCAGCCAGGGGCCATGTCTTCTTTCGTTGTTGGACCCATAACAAACACCTAGTGATGTCATCTCCACCATACGGCAGCAGAAAACGTGTTGATGGAATAGCAACCCCTTCCTCAACACACATGCCTGAGATAACTTGTGCACCCATGTTTACGATACATCCAGATGAAAAGCCATTCCCAAATGTAGCCGCAACGCATTCCTGGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCAAGTAGCGAAGGGTAAA反向引物:TGCCGTATGGTGGAGATG序列3齿肋赤藓Syntrichiacaninervis转录延伸因子核苷酸序列TTGAAGGTCTTTCTGATATAATCTTCCTTCTTTAAGCGAGTCTTTTCCTGCTCGTTGAGTAAGAAGGTGATGTCGGATTTAAAACGCTTGTCCCGGTGCTGCGTATCATCCCTAGACTCTTCCCGCATATCGCTTTCCTTGCATGTCAAATCGACCAAGTACTTATCCTTTTTCACCTCTTTCACTCGGCAAGTCACTGAAGTGCCTTCTGAAAATTTATCTTTAAGTTCAACATCGCCGTCATCTGAAACATCTTCCTTCTGAATGAAACCCAGTAATCCACATTCCAATACACACATGAGCTGATGTTCCTGCACTCTTCTTATTGTTGCTTGTACAATTCCACCTTCAAAGAGTGTCTCTTTGCTCTCCCCGGTCATGAGATAGAAACACTCTTCTTGAGACGGCTCCGAGTACGACCTCCGCCATTCTTGAAATCCTCGCTGCAGCTCAGATTTGATCAACTCCAGTGTCTTCAATCCCCGGCCTTCAACGTGTGCAGATTGGGCATACTCCGCAATGTCTACAGAATCTAAAGCGTTGGGATTTTTAATCACACGATCTACTGCCATACTTGGCACATCATCGTCCACTTCTTCGTTATTCCGCATGCCTTCCTTCTCGATCGCAGCTTCAGCTAGGTTCTTTGCCATCTGATACAACTCAGGGTGAATACGGGTGTTGTCTAAAAGCTCTGTAGGACGTAAATCTGAAGGTGTTTCTCCAATTTCACGCACTCGGATGAAACCAGCGGAATTTGTGAAGACTTTCTCATTCACAGCCCGTATGGTCGAGTAAAGACTATCTCGAGTCAATACACGCTTTACCACTTGAAGATTTGTCCGAAACTCACAAGCCTTCAGAGGGCCAAGACCCGCAACGAACTGAAGGGTCTCAAACAACCAGTCGTGGATAATAGCTAGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:ACTTGGCACATCATCGTCC反向引物:ATTCCGCTGGTTTCATCC序列4齿肋赤藓Syntrichiacaninervis钙依赖型蛋白激酶核苷酸序列TGAGATGTTTAAACACTACCTCAATTACATGCTGAAATCCAATACATTTGACGTAGAAGCATCAACAGTGTTTGGCACCTAATCATTTCCTCTCGGGCGCCTCTAGCGATGGCACTGAAAATGATACACGGGGACTAAAGGCCATGGCCCTAGAGCAAGTAACATGACAAACTTTACATATTCAAACTCCCCATGGTAAGGAGAGAGTGCTACTCGCCTCTGTAGAAGTGACTGGTTCGCACAGCCATGTTGAGGTGCCTACTTCCTGCTGAACTCGGTGTGAACCCTATCCTCCGATCCCCAACGCGTCGGTCAGATTCAACTGCTGGCTGTTGCGTAGCGATGAGCGACCAGCACCGCCCTTGTTGCCCTTGCGCATCATGTTGACGAACTCGGTGTAATCAATCTGGCCATCGTTGTTCTGGTCGACCTCCCTGAGCAGCTCCTCCACGGATACGTCTCCCATGTTGAATTCGGCCAACGCATGTTGCAGCTCATCGACCGTCAGATAGCCGCTGTTGTCCTTGTCTAGGTACGAGAAGGCGGCGAACATGTTCTCATCGCGTTCGACCTTGTTCAGGTGGAGAGTGGCGGCCAGAAACTCGCCATAATCGATTGCCCCACTGCCGTCGACGTCAGCGGCGTCCATGAGCTGCCGAACGTCTTCCTCTTTGAGATTGGAACCCACTTTCTTCAGACCCGCCTTCAGCTCCTCGTAGCTGATGGACCCTGAGTTGTCCGTGTCCATCATCTTGAACATCTCCTTCAGACCTGCGATCTCCTCCTCCGACAAGGACTCCGCGATCACCCGGATGGCGATCTTCTTCAGCTTGTTCATTGCGGAGAAGTGCTTGAGCCGGGATTGCACTGCGGAATCGATGGGTCTGTCGGGCGCTACTCCGTCCTCGCAGATCCAAGGATGTGCCAACACTTGATGGGCTTTCAACCTCTTCGAAGCCTGGGGCGTGAGCATTTTGCGGATCAAATCCTTGGCGCTATCAGAAATCTTAGGCCATGGATCTGATGCAAAATCAAGCTCTGATTTCAAAACCTGCTCAAAGATGCCCTGCTCCGTCTCTGCCCAGAATGGAGGGACTCCGCTGAGAAGGATGTAAAGTATCACACCCGCACTCCACACATCCGCTTCCGGGCCATAGTTCTTCCTCAACACTTCAGGTGCCACATAGTAAGGGCTTCCAACCACATCTCTGAAAACTTCTCCAGGTTTAAAGAACACTGATAGCCCAAAATCAGTC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CTACGGCAAGGGTCAAGGAGGTGGTGGGCAGATGGATCCCTCCGAAGCGGCGCGCACGCTGCAGGCCATGCTGCAATCATCCGTCGTGGTGGCGCTCCTCGTCAACCTTCTCGTCAACTTTTTCCTTCTCGTCACCCTCTCAATGAAGACTGTGTTCTTCGGTCAGTTGTCTCTGGTTGAGACTCAGAAGGTGGTGGAGCGCCTCATCAATTATGTATTATTCAAGGGCCTGTTCTTGACATGGGTCGTGAGGCCAGAAATGATGCAGATAGCTGTGTGGTTGGCGTGGTTCTCCGTCTTGGGCTTTCTGAAGATGTTCCAAGGTTTGGCAAGAGATCGTTTGGAGCGCTTAAATGCATCTCCTTCTGCGACAATGTTGGCTCACATAAGAGTTTATACGGTTCTCTTGTTCGTTCTTCTGTTCGATTTGCTCTGGATGCAGCTGTGTCTGCTTTTATTCAAAGACACTGGAACCAGTACCTTCTTGCTACTTTTGTTTGAGCCTCTCAGTATAGCATTTGACACTCTTCAGGCAGTAATTGTACACGGTATGCAGCTATTGGACACTTGGCAGCGGCAAAACCTTGATATTTCTGCACACGATATAAGTTTGCAGCCTTCTGAGAGGTCTGCTGCAGGTGCAGCTTGGGAGTGGCGTGGAACTGTTGTAAGAAATTGCAGCTTTGTGATGGATATTGTGAGCTTGTTACTGGCTTTGGGCCATTGCGTACACATCTGGTGGTTACGTGGGCTTGCTTTTCAAGTGGTGGATGCCATTCTTTTCCTCAACTTGCGCGCGCTATTGAGTGCTATTTCAAAAAGAATAAAAGGTTTCATGCGTCTTCGGGCAGCCATGACAACTCTGCAGGGTGCGCTTCCCGATGCAACGCAGGATGAACTCCTTGGATATGAAGATGATTGTGCCATTTGCAAGGAGCCCATGGCTAGGGCAAAACGGCTTCCTTGTGCTCATCTCTTCCATCTCGCGTGCTTGAGATCCTGGCTAGACCAAGGATTAGCAGACACATACTCTTGCCCGACCTGCCGTAGACCCCTCTTCATGGGCGGGTTCCGGACTGCAACAAACAATTTGCAGCGCCTGGTAGATGTGCCCACTGCATCCCCCGGCACAAATGAAACTCAGGCACAGGTTGCACAACGACAAGACTTAGCTGCAGCGCCGTCTCCACCTCTCACCACCTTGACTCCCGCTCCAGCACCG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AGCTTGTTACTGGCTTTGGG反向引物:GGAGTTCATCCTGCGTTGC序列10齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶1核苷酸序列TCCGGGATCAAGAACACCAATGCCGTCACCTTCGGCAAGCGCACTGATGACCTCGTCAGCGTTGTTGCTGCCCAGTCTGCTGTGTCTGCTAGCTCCGGAGCCACGAGGGCCGTGACCGAGGCCAAGATCAGGGTTGCCATTAACGGTTTTGGGCGTATTGGACGCAACTTCGTCCGCTGCTGGCATGGAAGGAAGGACTCGCCTCTCGAGGTCGTCGTGATCAACGACACCGGAGGCGTGAAGCAGGCTTCTCACCTGTTGAAGTACGACTCCATGCTCGGCACCTTCAATGCCGACGTGAAGGTCGACGGTGATGGCATCAGCGTTGATGGCAAGACCATCAAGGTGGTGTCCGACAGGAACCCGCTCAACTTGCCATGGGGGGATATGGACATCGACCTTGTCATTGAGGGGACCGGAGTGTTCGTCGACGAGGCTGGTGCCGGCAAGCACTTGCAGGCGGGAGCGAAGAAGGTGCTCATCACCGCCCCAGGAAAGGGTGCCATCCCCACGTACGTGATCGGAGTAAACGAGCAGGATTACACCCACGCGGACAAGATCATCAGCAACGCGTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCCCCGTTCGTGAAGGTGTTGGACGAGAAGTTCGGCATCATCAAGGGTACCATGACCACCACCCACTCATACACTGGTGACCAGAGGCTGCTGGACGCTTCCCACCGCGACTTGAGGAGAGCCCGTGCCGCGGCCCTGAACATCGTGCCCACCTCCACGGGAGCCGCCAAGGCCGTGGCGCTGGTGCTGCCGAGGCTGAAGGGCAAGATCAACGGAATCGCCCTGCGTGTGCCCACCCCCAACGTGTCCGTGGTGGACTTGGTGGTGCAGGTGGAGAAGAAGACGTTCGCGGAGGAGGTGAACCAGGCGTTCAGGGATGCGTGCGAGACCCCTCAGCTGAAGGGCATTTTGGCAGTGTGCGACGAGCCTTTGGTGTCGGTGGACTTCAGGTGCACTGACGTGTCGTCCACGGTGGACTCGTCCCTGACCATGGTGATGGGCGACGACATGGTGAAGGTTGTGGCATGGTACGACAACGAGTGGGGGTACTCGCAGCGGGTGGTGGACCTGGCTAACTTGGTAGCGGAGAAGTGGCAG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCGTTGTTGCTGCCCAGTC反向引物:AGGCGAGTCCTTCCTTCCAT序列11齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶2核苷酸序列ATCGGAAGACTCGTCCTCCGTGTGATTCTTGCCAGGGACGATGTGGAAGTTGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGACACCAAGTACATGGCATACCTGTTGAAGTACGATTCCACCCACGGGCTTCTCAAGGCTGATGTGCACGCTGTTGATGACAAGACTCTGCAAGTTGCTTCTCAAACCATCAAGGTCTTCGGATGCAGGGATCCCGCGGATATCCCATGGGGTGAAGCCGGTGCTGATTACGTGGTGGAGTCCACCGGTGTTTTCACCGCCGTTGCCGGCGCCTCGGCCCATTTCAAGGGAGGAGCCAAGAAGGTTGTTATTTCCGCACCATCGGGAGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCAGAACGCTTACAAGGATGACATGAACGTCGTCTCCAATGCCAGCTGCACCACCAACTGCCTTGCTCCCCTAGCTAAGGTGATCCAGGACGAGTTCGGCATTCTCGAGGGTCTGATGACCACCGTTCACGCCACTACCGCCACCCAGAAGACCGTCGATGGCCCATCAGGGAAGGACTGGCGTGGAGGACGTGGTGCTGGCCAGAACATCATCCCCAGCTCCACCGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTGTTGCCTGAGCTGAACGGCAAGTTGACCGGCATGGCGTTCCGTGTGCCCACCCCGAACGTTTCAGTGGTGGACTTGACTGTGCGCCTGGAGAAGGGTGGGTCCTACGAGGACGTCAAGGCAGCCATCAAGGCCGCCTCTGAAGGACCGATGCATGGCATCTTGGGCTACACCGAAGACGACGTGGTGTCGAACGACTTCATCGGTGACGCCAGGTCCAGCATCTTCGATGCTAAGGCAGGAATCGCTTTGAACGACAAGTTCGTCAAGTTGGTGTCGTGGTATGACAACGAGTGGGGCTACAGCAACCGTGTGGTGGACCTG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GGGCTTCTCAAGGCTGATGT反向引物:TCCACCACGTAATCAGCACC序列12齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervisxa0SAND蛋白核苷酸序列TCGGAAGTGGAAGCTGATAATACAGCGAAACTCTCAAACCTGGACATCAGTAGCAGCACGCAGGAGGACGGTTCAAAGCTTGAAACTCATGATGCAGAAGATGGTCCAAAAGCCTTGGACATGGGAGATGGAGAAGGTACTGCGCTCGCTGCTTCTACAACTACTGATGTTGTGCCGGAGAGTACTGTGGATGGAGATACATTGTCTGAAGATGGCATCCATGAGAGCCCTGTGAGTCCAAGCAGTAGCCGCGAAGGAACCAGTGGCTACTTAGCAGGCAGTGGCAGCAGTACCGCGAGTGTCTATAGCGCAAGTGGAGCAGATGAAAGTGCCGATCGAATTCTGAATCAGGATTCTATGCCACAAGCGACGAGGCGGTCTTGGGTCCCTGGAAAACGCCATCCAGATGAAGATGACACGTCTCTCGCTTGGCGAAAGCACAAGAAGCATTTCTTTATTCTCAGCAATGCAGGAAAACCA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AAAGCCTTGGACATGGGAGA反向引物:CGTCGCTTGTGGCATAGAA序列13齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis组蛋白3核苷酸序列CTAAAGACGGGAGAACGAAGACCCTTTTCTCCTCCTTCGGCTTCACCTCCCCATCTTTCTCTCTCGCTCACTCTCGACATCGTCATCTCTCTCGTATTCTACCTACACCGCCGTTTCATTTCCACAAGTGTCACTATGGCGCGTACGAAGCAGACGGCTCGTAAGTCCACCGGAGGAAAGGCTCCGAGGAAGCAGCTCGCCACGAAGGCTGCGAGGAAGTCGGCCCCCACCACCGGAGGAGTGAAGAAGCCCCATCGCTACAGGCCGGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCCGCAAGTACCAGAAGAGTACCGAGTTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGAGGCTGGTTCGTGAGATCGCCCAGGACTTCAAGACCGATCTGCGTTTCCAGAGCCACGCCGTGCTGGCGCTGCAGGAGGCGGCGGAGGCGTACCTGGTGGGTCTGTTCGAGGACACCAACTTGTGTGCCATCCACGCGAAGAGGGTGACCATCATGCCGAAGGACATCCAGCTGGCCCGCAGAATCAGGGGAGAGAGGGCTTAGGCCGGCTCGCCCGGAGTCTGTATGAAAAAACCCAAAAAAATCTAAAAAAAAGTTTGGGGTTCTTTTGAACCCACCAAAGGGGCGTGTACTCCGTGTATGTGGCATGATGTTACTTGTATGTTACTTGTATGTTTGTGCGGAGTGATTGCTGAAGCAGCCGAG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AGGAGTGAAGAAGCCCCATC反向引物:CGAACAGACCCACCAGGTAC序列14齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervisxa0F-盒蛋白核苷酸序列ATTCGTCTTTTTGTTTGGTTGCGTAAGTGTTTAGGTTGACACAATCCTCGTTTCGCTTCTAGGTTTTGTGTTTTGGCGTTTAAATCACTGAGGTTTCCCTGAAGACCTTTGATGCCATAGAGATGACGCTTTCCTTGTCCTGCTTACAGCTTGAGCTGGTGTGACAGTATCCGAATTTGCCCTAATTGGAGGGGCATGTGAAGCTCACGATCTGGGTCCGCTTACAAGCTCACAGCTTTAGTCAGTATTGACAACATGGGATGATCGTCTTGCAATCTCGAAGAAGCGATGGAGCAAGACGGATTGGATTCATGGAGCAGGCTACCGGAAGATGTCGTGCTGAGAGTGCTCACGCGCCTGCCAATTCCGCATCTTTTCCGCGCGCGCACGGTCTGCAAGCAATGGAATGCGCTCACTTCGACCCCGGAGTTTCTGGCCATGTGCAGCGCGCGTCACGCGCCCTACTTCCCGGTGGTGATCTCGCGCCGCTTCTACATGGGCGACCTGGGGATCTGCTTCCTGGGGAACGACTCGCAGGGCGGCAACGACCTCTTCCGCGTCTTCTTCGGCTACGACCATGAGGCGCAAGCGTGGCAGAAGCTGCCCCCGTTCGACTTCCTCCCGCACGAGGCGCGCATCCCGGTGGCCTCCGCCGGCGGCCTCATCTGCTTCCGCGGCACCTCCAGGCTCTTCCTGTGCAACCCCGTCGCCCGGAGCTTCCTGGAGCTCCCCGCCATCACGTACAAGTGGCCGCCGTCCGTCTCCGTGCACATCCTCGTGGAGAGCAGCGCCTTCAAAGTCATCATCGTGGGGAAGATCCGCCACAACTTCGTCACCGACTCCTTCCGCAGCATCGCCATCTACGAGTCCGTCACCAAGGCCTGGCGCGTCGTGGACGCGCCGCATCCCGCGAAGGTATTCTCCTACGGTCCCACTGCAGCCGTCTGCGGCAACTCCATCTACTGTGAGGCGATTTGCCATTGCGGCCAGCTGGGTGTGATGGCCTACGACGTCCAGTCCGAGACGTGGAACCCGGTGTTGCATGAGATTCCGAGTGATGAACGCGGCGAGTATCAGCTGACGCAAGTTGTG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:CGCCTTCAAAGTCATCATCG反向引物:GGCAAATCGCCTCACAGTAG序列15齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis18s核糖体RNA核苷酸序列TTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTTTGAGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGTCGGCCGGTCCGCCTCTGGTGTGCACCGGTCGTCTCGTCCCTTCTGCCGGCGATACGCTCCTGGTCTTAACTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCGCTGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGGATACATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GGAGAGGGAGCCTGAGA反向引物:CACCAGACTTGCCCTCCAA;b、分别选取干旱,高盐,冷,热,干热混合,脱落酸,氧化,机械损伤,重金属,紫外胁迫共10种非生物胁迫及无胁迫处理,总共11齿肋赤藓配子体样本为实验材料,进行荧光定量PCR模板实验;c、将实时荧光定量PCR得到的数据导入两个最常用的内参稳定性评价软件geNorm,NormFinder和一个内参稳定性综合评价软件Refinder进行内参稳定性和内参数目分析,筛选出最优内参分子和内参分子组合。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤a中所述的内参基因为18s核糖体RNA,肌动蛋白,α微管蛋白1,α微管蛋白2,β微管蛋白,甘油醛-3-磷酸脱氢酶1,甘油醛-3-磷酸脱氢酶2,泛素蛋白连接酶1,泛素蛋白连接酶2,钙依赖型蛋白激酶,F-盒蛋白,转录延伸因子,肌动蛋白相关蛋白,SAND蛋白,组蛋白3。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b中总共11齿肋赤藓配子体为完全复水24h后的经各种胁迫处理后的去除假根的叶片组织。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b中非生物胁迫处理的条件为:分别用20%聚乙二醇6000,250mM氯化钠,100μM脱落酸,0.5mM硫酸铜,50mM双氧水,0.5w/m²紫外辐射模拟干旱,高盐,脱落酸,重金属,氧化和紫外胁迫;将齿肋赤藓分别置于温度4°C冰箱和温度42°C光照培养箱模拟低温和高温胁迫;用10%PEG+温度42°C模拟干热混合胁迫,机械损伤胁迫是通过剪断叶片实现;所有处理均是在胁迫6h后取材,且取得的材料立即置于液氮中,并迅速置于温度-80°C冰箱储存。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b中实时荧光定量PCR模板均为1μgxa0RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液,且荧光定量程序为:第一步是预变性:温度95°C-30秒;第二步是PCR反应阶段,温度95°C-5秒,温度58°C-60°C,30秒,40个循环,收集荧光信号;第三步是溶解曲线分析,温度65°C-95°C,温度65°C在30秒逐步升至95°C,每0.5°C收集一次荧光信号。技术领域
本发明涉及一种适用于沙漠藓类齿肋赤藓各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法。
背景技术
干旱,高盐等非生物胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要因素,每年导致作物减产达50%以上。随着全球气候变暖,温室效应和土地沙漠化的加剧,干旱问题将日益突出,干旱对农业生产的影响也将更加严重。目前,利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力,已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。干旱区植物在长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力。干旱区严酷的自然环境孕育了特殊,天然,珍稀的逆境植物资源。荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓即为典型代表。齿肋赤藓(Syntrichiaxa0caninervisxa0Mitt.)隶属丛藓科、赤藓属,为典型的变水植物,是构成藓类结皮的优势种,自然干燥状态下呈灰黑色,似一层“壳”分布在沙漠表面,形成有重要生态意义的苔藓生物结皮,不仅具有较强的抗逆能力,而且在维持荒漠生态系统的稳定性和受损生态系统的恢复重建中起着重要的作用。此外,一旦遇到降水,齿肋赤藓即在30s内迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色,并开始执行光合作用,其独特的生理特性及抗旱性和耐热性的分子调控机制已成为国内外相关科学的研究热点。同时,长期的环境压力使得该种具有极好的抗旱,抗高温等抵抗多种非生物胁迫的能力,其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。目前,从极端抗旱藓类齿肋赤藓中发掘优质抗逆基因资源已经展开,特别是齿肋赤藓转录组数据库的建立,更是为该种的基因研究提供了很好的平台。目前,从齿肋赤藓中克隆,分析ALDH,HSP70,DREB等家族基因的工作正在展开。而要了解齿肋赤藓的抗逆机制以及挖掘丰富的抗逆基因资源,很关键的一个方法就是要分离这些基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交,生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基因表达量上,或存在缺陷,或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展,实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法,该法不仅灵敏度高,样品消耗量少,能检测出低丰度靶基因表达量,定量线性宽,但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化,从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。因此,合适稳定的内参基因的选择则是齿肋赤藓抗逆机制和抗逆基因研究的基础。以往对内参基因的稳定性研究证实,任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的植物或特定实验因素作用下的相对恒定,在其他类型的植物中或不同实验处理下稳定性则很可能是变化的。若盲目的参考别的物种中稳定的一个内参或或几个内参基因,一方面可能使基因表达的微小差异难以发现,另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。近年来,内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。随着人们对内参基因稳定行问题的越来越重视,目前,已开发出基于Excel程序多种软件,用于评价内参基因的稳定性和变异系数,其中应用最普遍的为GeNorm和NormFinder程序。综上所述,荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓是研究沙漠藓类抗逆机制和挖掘优良抗逆基因的好材料。研究和筛选齿肋赤藓中最稳定的内参基因是进行该种基因定量研究(荧光定量PCR实验)的先决条件。近年来,做为极端抗旱藓类的齿肋赤藓的分子水平工作陆续展开,从齿肋赤藓中已克隆出一些抗逆基因,如乙醛脱氢酶基因ALDH21(NCBI登录号:GQ245973),特别是近年来本课题组对齿肋赤藓转录组,蛋白组等高通量测序结果的相继获得,更是加快了齿肋赤藓的分子研究工作。很多抗逆基因的特性和功能亟待研究,但关于该种的内参基因的序列资料未见报道,最合适内参分子的研究和筛选工作更是空白。因此,本发明就旨在找到一种在非生物胁迫条件下齿肋赤藓开展实时荧光定量PCR研究最稳定,最合适的内参分子的筛选方法,为以后大规模开展抗逆基因特性及功能研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,该方法利用实时荧光定量PCR方法研究苔藓植物抗逆相关基因功能时,缺少适用的、可靠的、表达恒定的内参分子,提出了一种适用于沙漠藓类齿肋赤藓在非生物胁迫条件下开展实时荧光定量PCR研究的最稳定,最合适的内参分子的筛选方法;利用齿肋赤藓转录组测序得到的数据库,选取了15个齿肋赤藓候选内参基因,并以这些基因序列为基础设计实时荧光定量PCR的内参基因特异引物。选取受10种非生物胁迫和没有胁迫(对照)的齿肋赤藓为实验材料进行荧光定量PCR实验验证,运用三大内参稳定性评估软件包括geNorm,NormFinder和Refinder进行荧光定量数据的分析,从而筛选出齿肋赤藓开展各种非生物胁迫下荧光定量研究的最适合,最稳定的内参分子。运用本发明所述方法筛选的内参分子,可避免在多种非生物胁迫下齿肋赤藓样本在RNA产量,质量及反转录效率上可能存在的差别,能更好的对实时荧光定量PCR检测出的数据进行校正和标准化,提高对该种基因定量研究的准确性和可靠性。本发明所述的一种沙漠藓类齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,按下列步骤进行:a、利用齿肋赤藓转录组测序数据,挑选15个齿肋赤藓内参候选基因,并以挑选的15个齿肋赤藓序列为基础设计了15对实时荧光定量PCR的内参基因引物,其中15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为:>序列1齿肋赤藓SyntrichiacaninervisActin(ACT)核苷酸序列ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACAGAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGGCGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGAGGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACCGGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCATTCTGCGGCTGGACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGGCCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACACAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGCGGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTACAACTCGATCATGAAGTGTGACGTCGATATCCGTAAAGACCTGTACGGAAACATCGTGTTGTCTGGAGGATCGACCATGTTCCCGGGCATCGCCGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCGCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCGCCGCCGGAGAGGAAGTACAGTGTCTGGATCGGAGGATCCATCTTGGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTGCGAAGAGCGAGTACGATGAGTCCGGTCCATCGATTGTGCACAGGAAGTGCTTT实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:TCGTGTTGTCTGGAGGATCG反向引物:TACTCGCTCTTCGCAATCCA>序列2齿肋赤藓Syntrichiacaninervis肌动蛋白相关蛋白(ARP)核苷酸序列GTGAGCCATGAGTTGAAACTAATAAATTGGAAAGAAAAACAAGCTCAGAAAATGAGCGTACATCGTTGAGACGGTCAGACGAACCATTATCTACGGACATGCGTATTGCGTTGTTCAGGAATGTTCTTTGCGTGGAACTCGGTGTCGGTAACTGGAAGATGTTGACGCAGTTGCTGCTGTTACCTTGCTGACCAAGTTTAGTCCAACATGGCATTGTACCAAAAAGCTTGCGCCTGGAGGGTGTTGGAGTCCCTGTACTTTCGGCCGCTGCCCACCATGACCATACCGTCCAACCAGTCCTCGTACTGCACCCATGAGTCGCGTCCGAAGTCCAAGACGGCGAGAACCGCGCCACCTTTCCACATGATATTCATTGGAGCCATTCGATTTTGAAGAACCTCCACAGTGTCCACAGCTTCGTCCACAGGTATGGCGTGCAGAACCCTCTCCTCAACAGCATCAACCAGGCCTTTCGTTAACCCAACGCCGCCAACCAGCTGAATACTCGCGAACAGCTTCTTCTGAAGATCCACGCGACCTAACGACAGGATACTTTTCACAATAGCTTGTGCAAGGCCACTTGAAGCTTCTTCCACCTCTTTCTTCCCTTTATCTTCAAAGTCGTACGGATCGGAATCATTGTTAATAGAGTTTCCATTAACACTTCCGTTGGTTCCTCCTGTTTCATTTGTCTCAATACGTCGGACAGCTTCAGAAAATGAATCTTCCGCAGTATCTTCATAATCTACGTGATACCAGGGTCGAGGAAGAATCGAATACTCTTCCAGTGCAAGTAGCGAAGGGTAAAATAGTCCCATGGGTGGAATGTTGATGGAAGATAATACGACTGTATATACTCGAGTTGGCTCGCCTGCCATGCGGCACTTGATATCAACCGTCGTGTGTTGCTCACCTTCCAGAAGCACGCAGTGGGTCTCCTTCAGTTTCTCAAGAGTCAAAAAGTCCAACGGATCACGCAAAGGATCAGTATCAGCCAGGGGCCATGTCTTCTTTCGTTGTTGGACCCATAACAAACACCTAGTGATGTCATCTCCACCATACGGCAGCAGAAAACGTGTTGATGGAATAGCAACCCCTTCCTCAACACACATGCCTGAGATAACTTGTGCACCCATGTTTACGATACATCCAGATGAAAAGCCATTCCCAAATGTAGCCGCAACGCATTCCTGGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCAAGTAGCGAAGGGTAAA反向引物:TGCCGTATGGTGGAGATG>序列3齿肋赤藓Syntrichiacaninervis转录延伸因子(SPT)核苷酸序列TTGAAGGTCTTTCTGATATAATCTTCCTTCTTTAAGCGAGTCTTTTCCTGCTCGTTGAGTAAGAAGGTGATGTCGGATTTAAAACGCTTGTCCCGGTGCTGCGTATCATCCCTAGACTCTTCCCGCATATCGCTTTCCTTGCATGTCAAATCGACCAAGTACTTATCCTTTTTCACCTCTTTCACTCGGCAAGTCACTGAAGTGCCTTCTGAAAATTTATCTTTAAGTTCAACATCGCCGTCATCTGAAACATCTTCCTTCTGAATGAAACCCAGTAATCCACATTCCAATACACACATGAGCTGATGTTCCTGCACTCTTCTTATTGTTGCTTGTACAATTCCACCTTCAAAGAGTGTCTCTTTGCTCTCCCCGGTCATGAGATAGAAACACTCTTCTTGAGACGGCTCCGAGTACGACCTCCGCCATTCTTGAAATCCTCGCTGCAGCTCAGATTTGATCAACTCCAGTGTCTTCAATCCCCGGCCTTCAACGTGTGCAGATTGGGCATACTCCGCAATGTCTACAGAATCTAAAGCGTTGGGATTTTTAATCACACGATCTACTGCCATACTTGGCACATCATCGTCCACTTCTTCGTTATTCCGCATGCCTTCCTTCTCGATCGCAGCTTCAGCTAGGTTCTTTGCCATCTGATACAACTCAGGGTGAATACGGGTGTTGTCTAAAAGCTCTGTAGGACGTAAATCTGAAGGTGTTTCTCCAATTTCACGCACTCGGATGAAACCAGCGGAATTTGTGAAGACTTTCTCATTCACAGCCCGTATGGTCGAGTAAAGACTATCTCGAGTCAATACACGCTTTACCACTTGAAGATTTGTCCGAAACTCACAAGCCTTCAGAGGGCCAAGACCCGCAACGAACTGAAGGGTCTCAAACAACCAGTCGTGGATAATAGCTAGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:ACTTGGCACATCATCGTCC反向引物:ATTCCGCTGGTTTCATCC>序列4齿肋赤藓Syntrichiacaninervis钙依赖型蛋白激酶(CDPK)核苷酸序列TGAGATGTTTAAACACTACCTCAATTACATGCTGAAATCCAATACATTTGACGTAGAAGCATCAACAGTGTTTGGCACCTAATCATTTCCTCTCGGGCGCCTCTAGCGATGGCACTGAAAATGATACACGGGGACTAAAGGCCATGGCCCTAGAGCAAGTAACATGACAAACTTTACATATTCAAACTCCCCATGGTAAGGAGAGAGTGCTACTCGCCTCTGTAGAAGTGACTGGTTCGCACAGCCATGTTGAGGTGCCTACTTCCTGCTGAACTCGGTGTGAACCCTATCCTCCGATCCCCAACGCGTCGGTCAGATTCAACTGCTGGCTGTTGCGTAGCGATGAGCGACCAGCACCGCCCTTGTTGCCCTTGCGCATCATGTTGACGAACTCGGTGTAATCAATCTGGCCATCGTTGTTCTGGTCGACCTCCCTGAGCAGCTCCTCCACGGATACGTCTCCCATGTTGAATTCGGCCAACGCATGTTGCAGCTCATCGACCGTCAGATAGCCGCTGTTGTCCTTGTCTAGGTACGAGAAGGCGGCGAACATGTTCTCATCGCGTTCGACCTTGTTCAGGTGGAGAGTGGCGGCCAGAAACTCGCCATAATCGATTGCCCCACTGCCGTCGACGTCAGCGGCGTCCATGAGCTGCCGAACGTCTTCCTCTTTGAGATTGGAACCCACTTTCTTCAGACCCGCCTTCAGCTCCTCGTAGCTGATGGACCCTGAGTTGTCCGTGTCCATCATCTTGAACATCTCCTTCAGACCTGCGATCTCCTCCTCCGACAAGGACTCCGCGATCACCCGGATGGCGATCTTCTTCAGCTTGTTCATTGCGGAGAAGTGCTTGAGCCGGGATTGCACTGCGGAATCGATGGGTCTGTCGGGCGCTACTCCGTCCTCGCAGATCCAAGGATGTGCCAACACTTGATGGGCTTTCAACCTCTTCGAAGCCTGGGGCGTGAGCATTTTGCGGATCAAATCCTTGGCGCTATCAGAAATCTTAGGCCATGGATCTGATGCAAAATCAAGCTCTGATTTCAAAACCTGCTCAAAGATGCCCTGCTCCGTCTCTGCCCAGAATGGAGGGACTCCGCTGAGAAGGATGTAAAGTATCACACCCGCACTCCACACATCCGCTTCCGGGCCATAGTTCTTCCTCAACACTTCAGGTGCCACATAGTAAGGGCTTCCAACCACATCTCTGAAAACTTCTCCAGGTTTAAAGAACACTGATAGCCCAAAATCAGTCGTTTTCAGAGCCGCATCCTCCTTCGTACTCGAAAACAGGAAGTTCTCCGGCTTCAAATCTCTGTGCATCACGCCAAGAGAATGGCAGGTCTCAACCACGCCCACGATAGTACGAGTGAGCACTGCCGCTTTGGCTTCCGAGTACTGTCCTCGTTGAATGATGCGGTCAAACAGCTCACCGCCTGCACAAAGCTCCATCACCAGATGCACTGAAGCAGGATCCTCATACGCCCCCTTGATCATGACAATGTTCGGATGTCCTGAAAGGTGATGCATGATCTGCAGTTCACGGCGAACGTCATCCACGTCTTCCTTGGAGATAAGCTTCCGCTTGGCAATAGACTTGCATGCGTACTCCCTGTTGGTGGCCTTCTCAATGCACAGGTAGGTGGTGCCGAATTGACCTTGCCCCAGCTTCTTTCCCAGAACATACAGGTCTCTGAGGTTCTCTGTCTTCCGCTGCAGCACAGAGTGAGTCAGACTCTGGCCAGGGACGGGCTTCATCTCTCTCCCTTTCTTCATGGCTTCGATCACTTCTTTGAATTGCTGAGTTTCGGCCGGTTCCACAGCAGGGATGTGAGCTGGGCGTGGCGGTTTCCGTTGAGTCTCCGGGGACTCCGCCTCTGCCCTGCTCCCCCCTCTGGACTCTGCCTTGGATGGAGTGGGTGATACCTCACTAGGGGATCTGGAGCTACGCCCTCCCAGTGCGATCACACTGGTGAAGCCCTGAAAGTACCCAGCCGCTCCTACACAACTGTTGCCCATTCAGACACAATCTGTAACATCCCTCCACGGGAATCTATTTATCCCGTTCCCCTAAACTTGTCTCTTAAAGCAAAGGCCTAAACATACACTACAACGAACTTGATGCCGTTTTTGTCACCATTTGGCCACGTACCTTCGCACAATCATCTGAAGTAAGAACAGGCTGAGGAGAAAGACCGCCGTCTAGGGTTTCAAGGCTGAGAAGCGAACCCTGAAATGAGTGTAAGGTGGCCGAAACTGACTTCAAAGAGAGAACTGGCGGCCAGGTTTCCTCAGTTATTCTTTCCAGTCTCAAACCTCGAGCTCCGGCTGCGAAATAATCTGGCAGCGAAAGTGGCAGCAAAAACAAGCAGCTCTCGCACTATTTTCC实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AACACTTCAGGTGCCACATAG反向引物:GCATCATTCAACGAGGACAG>序列5齿肋赤藓Syntrichiacaninervisα微管蛋白(α-TUB1)核苷酸序列GTGGATGTGACGGAGTTCCAGACGAACTTGGTGCCGTACCCCCGTATCCACTTCATGCTTTCGTCTTACGCGCCGGTGATCTCGGCCGAGAAGGCGTACCATGAGCAGCTGTCCGTCGCGGAGATCACCAACTCTGCGTTCGAGCCGTCGTCTATGATGGCGAAGTGCGACCCCCGTCACGGGAAGTACATGGCGTGCTGCCTGATGTACAGAGGAGACGTTGTGCCGAAGGACGTGAACGCGGCAGTGGCAACGATCAAGACGAAGAGGACGATCCAGTTCGTGGACTGGTGCCCGACCGGGTTCAAGTGCGGAATCAACTACCAGCCCCCGACGGTGGTGCCCGGAGGCGACCTGGCGAAGGTGCAGCGGGCGGTGTGCATGATCAGCAACAACACGGCGGTGGCGGAGGTGTTCTCCCGGATCGACCACAAGTTCGATCTCATGTACGCGAAGCGCGCGTTCGTGCACTGGTACGTGGGCGAGGGCATGGAAGAGGGTGAGTTTTCGGAGGCCCGTGAGGACTTGGCTGCGCTCGAGAAGGACTACGAAGAAGTGGGCGCGGAGTCGACGGACGGCGCCAACGACGACGATGACTAC实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:CGTCGTCTATGATGGCGAAGT反向引物:TCTTGATCGTTGCCACTGCC>序列6齿肋赤藓Syntrichiacaninervisα微管蛋白2(α-TUB2)核苷酸序列ATGAGAGAGATCATCAGTATCCACATCGGCCAGGCCGGTATCCAGGTCGGCAACGCCTGCTGGGAGCTCTACTGCCTCGAGCACGGCATCCAGCCCGATGGCCGCATGCCTAGTGACGCGTCTACAGGAGGTGGAGACGATGCGTTCAACACCTTCTTCAGCGAGACCGGGGCGGGGAAGCACGTGCCGCGGGCTGTGTTTGTGGATCTGGAGCCGACCGTGATCGATGAGGTGCGCACGGGGACGTACCGGCAGCTGTTTCACCCGGAGCAGCTTATTTCCGGGAAGGAGGACGCCGCTAACAACTTCGCTCGCGGTCATTACACCGTGGGAAAGGAGATTGTGGACTTGTGCTTGGACCGGGTGAGGAAGCTGGCAGACAACTGCACGGGCCTGCAGGGATTTTTGGTATTCAATGCTGTGGGAGGAGGCACGGGATCGGGACTCGGTTCGCTGTTGCTGGAGAGGCTCTCAGTAGACTACGGAAAGAAGTCCAAGTTGGGATTCACCATCTACCCGTCTCCTCAGGTGTCCACCGCAGTTGTGGAGCCGTACAACAGTGTGCTGTCGACTCACAGTCTGTTGGAGCACACCGATGTGGCGGTGTTGCTGGACAATGAGGCCATTTACGACATCTGCCGGCGCTCGTTGGACATCGAGCGGCCGACGTACACGAACCTGAACAGGCTGATCTCGCAGATCATTTCGAGTCTGACGACGAGCCTGCGGTTTGACGGCGCGCTGAACGTGGACATCACTGAGTTCCAGACCAACTTGGTGCCG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:CGGTCATTACACCGTGGGAA反向引物:CCTCTCCAGCAACAGCGAA>序列7Syntrichiaxa0caninervisxa0β微管蛋白(β-TUB)核苷酸序列ATGAGAGAGATCCTCCACATCCAGGGCGGGCAGTGCGGGAACCAAATCGGTTCCAAGTTCTGGGAGGTGGTGTGCGAGGAGCACGGGATTGACCCCACCGGCTCGTACCAGGGGGTGTCTGACCTGCAGCTCGAGCGCATCAATGTGTACTTTGATGAGGCCAGCGGCGGGCGCTACGTGCCGCGCGCGGTGCTCATGGATCTGGAGCCCGGCACCATGGACAGCGTCCGCACTGGCCCCTACGGCCAGATCTTCCGCCCCGACAACTTCGTCTTCGGACAGACCGGCGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGCCACTACACCGAGGGCGCGGAGCTCATCGACTCAGTGCTGGACGTCGTGCGCAAGGAGGTTGAGAGCTGCGACTGCCTGCAAGGCTTCCAGTTCTGCCATTCTTTGGGAGGAGGAACGGGATCTGGAATGGGAACGCTTTTGATATCTAAGATCCGCGAGGAGTACCCCGATAGAATGATGCTTACGTTTTCCGTGTTCCCCTCTCCGAAGGTGTCCGACACCGTGGTGGAGCCTTACAATGCTACTCTCTCAGTGCATCAGCTGGTGGAGAATGCCGACGAGTGTATGGTGTTGGATAACGAGGCGCTGTACGACATCTGCTTTAGGACTTTGAAGCTGATCACCCCCTCATTTGGAGACTTGAACCATTTGATTTCTGCGACGATGAGTGGTATCACCTGTTGCCTGCGTTTCCCCGGACAGCTGAACTCTGACTTGCGGAAGCTGGCGGTGAACCTCATCCCGTTCCCCCGGTTGCACTTCTTCATGATCGGTTTCGCGCCTTTGACCTCCCGTGGCTCACAGCAGTACCGGTCGCTCACCGTGCCGGAGCTGACGCAGCAGATGTGGGACTCAAAGAACATGATGTGCGCGGCGGATCCGCGTCACGGGCGCTACTTGACGGCTTCCGCGGTGTTCCGCGGCAAGGTGTCCACCAAGGAGGTCGACGAGCAAATGATCAACGTGCAGAACAAGAACTCATCCTATTTCGTTGAGTGGATCCCGAACAACGTGAAGTCGTCTGTCTGCGACATCCCCCCGACGGGTCTGAAGATGTCGTCGACGTTCATCGGGAACTCGACGTCCATCCAGGAAATGTTCCGGCGCGTGTCGGAGCAGTTCACGGCCATGTTCAGGAGGAAGGCGTTTCTGCATTGGTACACGGGCGAGGGCATGGACGAGATGGAGTTCACAGAGGCGGAGAGCAACATGAACGATCTGGTGTCGGAGTACCAGCAGTACCAGGACGCGAGCGCCGAAGAGGAAGGCGAGTACGAGGACGACCTTGAGGAGGCC实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:CTTTGACCTCCCGTGGCTC反向引物:GTTCGGGATCCACTCAACGA>序列8齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis泛素蛋白连接酶1(UBR1)核苷酸序列GCGCTTGTGAACGAGCTCATCACCAAGTTGTCCAGCCGGAGCACCAAGGTACATCGGGATGCTGCCAAGACCATAAGGTGCCTAGCGAAGATAAACAAAGAGAATCGAATTCTTATTGCGGAGCAGGGAGGCATACCTTTCTTGATCAACCTTCTCCGATCGCCTGATGAGGAGACGCAGGAGCACGCCATCACCGCGTTGATGAACCTGTCCTTGCATCCAAACAACAGAGGGCTCATCATGAGAGCAGGGGCCATAGACGGCATCGTTCACGTAGTGAAGCATGGCGAGAGCACGGACGCGCGCGAGAACGCAGCAGCAGCAATCCAGTGCCTCTCGTATGACAACGAGAACAAGATCTCCATCGGCAACACGGGTGCGATCCCCGCGCTCGTTCAGCTGCTGCGCACCGGGACTCGCCAGGGCAAGAAGGACGCGGCCCACGCGCTCTGCAACCTCGTCAGCTACCTGGACGGCAACAAGAAGCGCGCGGTGGACGCCGGCCTCACACCCCTCCTCATGGCGGTTCTGCGCGAC实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCAGGGAGGCATACCTTTCTT反向引物:ATGAGCCCTCTGTTGTTTGGA>序列9齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis泛素蛋白连接酶2(UBR2)核苷酸序列ATGGGGTTAGGGTATGGGCCAGTGGTGGCATTGTACACGGCGTTGAGTGTGGGTGGGATAGCATGGAAGCTCAACTCAGCGTGGTGGACTATGACCTACGGCAAGGGTCAAGGAGGTGGTGGGCAGATGGATCCCTCCGAAGCGGCGCGCACGCTGCAGGCCATGCTGCAATCATCCGTCGTGGTGGCGCTCCTCGTCAACCTTCTCGTCAACTTTTTCCTTCTCGTCACCCTCTCAATGAAGACTGTGTTCTTCGGTCAGTTGTCTCTGGTTGAGACTCAGAAGGTGGTGGAGCGCCTCATCAATTATGTATTATTCAAGGGCCTGTTCTTGACATGGGTCGTGAGGCCAGAAATGATGCAGATAGCTGTGTGGTTGGCGTGGTTCTCCGTCTTGGGCTTTCTGAAGATGTTCCAAGGTTTGGCAAGAGATCGTTTGGAGCGCTTAAATGCATCTCCTTCTGCGACAATGTTGGCTCACATAAGAGTTTATACGGTTCTCTTGTTCGTTCTTCTGTTCGATTTGCTCTGGATGCAGCTGTGTCTGCTTTTATTCAAAGACACTGGAACCAGTACCTTCTTGCTACTTTTGTTTGAGCCTCTCAGTATAGCATTTGACACTCTTCAGGCAGTAATTGTACACGGTATGCAGCTATTGGACACTTGGCAGCGGCAAAACCTTGATATTTCTGCACACGATATAAGTTTGCAGCCTTCTGAGAGGTCTGCTGCAGGTGCAGCTTGGGAGTGGCGTGGAACTGTTGTAAGAAATTGCAGCTTTGTGATGGATATTGTGAGCTTGTTACTGGCTTTGGGCCATTGCGTACACATCTGGTGGTTACGTGGGCTTGCTTTTCAAGTGGTGGATGCCATTCTTTTCCTCAACTTGCGCGCGCTATTGAGTGCTATTTCAAAAAGAATAAAAGGTTTCATGCGTCTTCGGGCAGCCATGACAACTCTGCAGGGTGCGCTTCCCGATGCAACGCAGGATGAACTCCTTGGATATGAAGATGATTGTGCCATTTGCAAGGAGCCCATGGCTAGGGCAAAACGGCTTCCTTGTGCTCATCTCTTCCATCTCGCGTGCTTGAGATCCTGGCTAGACCAAGGATTAGCAGACACATACTCTTGCCCGACCTGCCGTAGACCCCTCTTCATGGGCGGGTTCCGGACTGCAACAAACAATTTGCAGCGCCTGGTAGATGTGCCCACTGCATCCCCCGGCACAAATGAAACTCAGGCACAGGTTGCACAACGACAAGACTTAGCTGCAGCGCCGTCTCCACCTCTCACCACCTTGACTCCCGCTCCAGCACCG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AGCTTGTTACTGGCTTTGGG反向引物:GGAGTTCATCCTGCGTTGC>序列10齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)核苷酸序列TCCGGGATCAAGAACACCAATGCCGTCACCTTCGGCAAGCGCACTGATGACCTCGTCAGCGTTGTTGCTGCCCAGTCTGCTGTGTCTGCTAGCTCCGGAGCCACGAGGGCCGTGACCGAGGCCAAGATCAGGGTTGCCATTAACGGTTTTGGGCGTATTGGACGCAACTTCGTCCGCTGCTGGCATGGAAGGAAGGACTCGCCTCTCGAGGTCGTCGTGATCAACGACACCGGAGGCGTGAAGCAGGCTTCTCACCTGTTGAAGTACGACTCCATGCTCGGCACCTTCAATGCCGACGTGAAGGTCGACGGTGATGGCATCAGCGTTGATGGCAAGACCATCAAGGTGGTGTCCGACAGGAACCCGCTCAACTTGCCATGGGGGGATATGGACATCGACCTTGTCATTGAGGGGACCGGAGTGTTCGTCGACGAGGCTGGTGCCGGCAAGCACTTGCAGGCGGGAGCGAAGAAGGTGCTCATCACCGCCCCAGGAAAGGGTGCCATCCCCACGTACGTGATCGGAGTAAACGAGCAGGATTACACCCACGCGGACAAGATCATCAGCAACGCGTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCCCCGTTCGTGAAGGTGTTGGACGAGAAGTTCGGCATCATCAAGGGTACCATGACCACCACCCACTCATACACTGGTGACCAGAGGCTGCTGGACGCTTCCCACCGCGACTTGAGGAGAGCCCGTGCCGCGGCCCTGAACATCGTGCCCACCTCCACGGGAGCCGCCAAGGCCGTGGCGCTGGTGCTGCCGAGGCTGAAGGGCAAGATCAACGGAATCGCCCTGCGTGTGCCCACCCCCAACGTGTCCGTGGTGGACTTGGTGGTGCAGGTGGAGAAGAAGACGTTCGCGGAGGAGGTGAACCAGGCGTTCAGGGATGCGTGCGAGACCCCTCAGCTGAAGGGCATTTTGGCAGTGTGCGACGAGCCTTTGGTGTCGGTGGACTTCAGGTGCACTGACGTGTCGTCCACGGTGGACTCGTCCCTGACCATGGTGATGGGCGACGACATGGTGAAGGTTGTGGCATGGTACGACAACGAGTGGGGGTACTCGCAGCGGGTGGTGGACCTGGCTAACTTGGTAGCGGAGAAGTGGCAG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCGTTGTTGCTGCCCAGTC反向引物:AGGCGAGTCCTTCCTTCCAT>序列11齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)核苷酸序列ATCGGAAGACTCGTCCTCCGTGTGATTCTTGCCAGGGACGATGTGGAAGTTGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGACACCAAGTACATGGCATACCTGTTGAAGTACGATTCCACCCACGGGCTTCTCAAGGCTGATGTGCACGCTGTTGATGACAAGACTCTGCAAGTTGCTTCTCAAACCATCAAGGTCTTCGGATGCAGGGATCCCGCGGATATCCCATGGGGTGAAGCCGGTGCTGATTACGTGGTGGAGTCCACCGGTGTTTTCACCGCCGTTGCCGGCGCCTCGGCCCATTTCAAGGGAGGAGCCAAGAAGGTTGTTATTTCCGCACCATCGGGAGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCAGAACGCTTACAAGGATGACATGAACGTCGTCTCCAATGCCAGCTGCACCACCAACTGCCTTGCTCCCCTAGCTAAGGTGATCCAGGACGAGTTCGGCATTCTCGAGGGTCTGATGACCACCGTTCACGCCACTACCGCCACCCAGAAGACCGTCGATGGCCCATCAGGGAAGGACTGGCGTGGAGGACGTGGTGCTGGCCAGAACATCATCCCCAGCTCCACCGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTGTTGCCTGAGCTGAACGGCAAGTTGACCGGCATGGCGTTCCGTGTGCCCACCCCGAACGTTTCAGTGGTGGACTTGACTGTGCGCCTGGAGAAGGGTGGGTCCTACGAGGACGTCAAGGCAGCCATCAAGGCCGCCTCTGAAGGACCGATGCATGGCATCTTGGGCTACACCGAAGACGACGTGGTGTCGAACGACTTCATCGGTGACGCCAGGTCCAGCATCTTCGATGCTAAGGCAGGAATCGCTTTGAACGACAAGTTCGTCAAGTTGGTGTCGTGGTATGACAACGAGTGGGGCTACAGCAACCGTGTGGTGGACCTG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GGGCTTCTCAAGGCTGATGT反向引物:TCCACCACGTAATCAGCACC>序列12齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervisxa0SAND蛋白(SAND)核苷酸序列TCGGAAGTGGAAGCTGATAATACAGCGAAACTCTCAAACCTGGACATCAGTAGCAGCACGCAGGAGGACGGTTCAAAGCTTGAAACTCATGATGCAGAAGATGGTCCAAAAGCCTTGGACATGGGAGATGGAGAAGGTACTGCGCTCGCTGCTTCTACAACTACTGATGTTGTGCCGGAGAGTACTGTGGATGGAGATACATTGTCTGAAGATGGCATCCATGAGAGCCCTGTGAGTCCAAGCAGTAGCCGCGAAGGAACCAGTGGCTACTTAGCAGGCAGTGGCAGCAGTACCGCGAGTGTCTATAGCGCAAGTGGAGCAGATGAAAGTGCCGATCGAATTCTGAATCAGGATTCTATGCCACAAGCGACGAGGCGGTCTTGGGTCCCTGGAAAACGCCATCCAGATGAAGATGACACGTCTCTCGCTTGGCGAAAGCACAAGAAGCATTTCTTTATTCTCAGCAATGCAGGAAAACCA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AAAGCCTTGGACATGGGAGA反向引物:CGTCGCTTGTGGCATAGAA>序列13齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis组蛋白3(HIS3)核苷酸序列CTAAAGACGGGAGAACGAAGACCCTTTTCTCCTCCTTCGGCTTCACCTCCCCATCTTTCTCTCTCGCTCACTCTCGACATCGTCATCTCTCTCGTATTCTACCTACACCGCCGTTTCATTTCCACAAGTGTCACTATGGCGCGTACGAAGCAGACGGCTCGTAAGTCCACCGGAGGAAAGGCTCCGAGGAAGCAGCTCGCCACGAAGGCTGCGAGGAAGTCGGCCCCCACCACCGGAGGAGTGAAGAAGCCCCATCGCTACAGGCCGGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCCGCAAGTACCAGAAGAGTACCGAGTTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGAGGCTGGTTCGTGAGATCGCCCAGGACTTCAAGACCGATCTGCGTTTCCAGAGCCACGCCGTGCTGGCGCTGCAGGAGGCGGCGGAGGCGTACCTGGTGGGTCTGTTCGAGGACACCAACTTGTGTGCCATCCACGCGAAGAGGGTGACCATCATGCCGAAGGACATCCAGCTGGCCCGCAGAATCAGGGGAGAGAGGGCTTAGGCCGGCTCGCCCGGAGTCTGTATGAAAAAACCCAAAAAAATCTAAAAAAAAGTTTGGGGTTCTTTTGAACCCACCAAAGGGGCGTGTACTCCGTGTATGTGGCATGATGTTACTTGTATGTTACTTGTATGTTTGTGCGGAGTGATTGCTGAAGCAGCCGAG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AGGAGTGAAGAAGCCCCATC反向引物:CGAACAGACCCACCAGGTAC>序列14齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervisxa0F-盒蛋白(F-BOX)核苷酸序列ATTCGTCTTTTTGTTTGGTTGCGTAAGTGTTTAGGTTGACACAATCCTCGTTTCGCTTCTAGGTTTTGTGTTTTGGCGTTTAAATCACTGAGGTTTCCCTGAAGACCTTTGATGCCATAGAGATGACGCTTTCCTTGTCCTGCTTACAGCTTGAGCTGGTGTGACAGTATCCGAATTTGCCCTAATTGGAGGGGCATGTGAAGCTCACGATCTGGGTCCGCTTACAAGCTCACAGCTTTAGTCAGTATTGACAACATGGGATGATCGTCTTGCAATCTCGAAGAAGCGATGGAGCAAGACGGATTGGATTCATGGAGCAGGCTACCGGAAGATGTCGTGCTGAGAGTGCTCACGCGCCTGCCAATTCCGCATCTTTTCCGCGCGCGCACGGTCTGCAAGCAATGGAATGCGCTCACTTCGACCCCGGAGTTTCTGGCCATGTGCAGCGCGCGTCACGCGCCCTACTTCCCGGTGGTGATCTCGCGCCGCTTCTACATGGGCGACCTGGGGATCTGCTTCCTGGGGAACGACTCGCAGGGCGGCAACGACCTCTTCCGCGTCTTCTTCGGCTACGACCATGAGGCGCAAGCGTGGCAGAAGCTGCCCCCGTTCGACTTCCTCCCGCACGAGGCGCGCATCCCGGTGGCCTCCGCCGGCGGCCTCATCTGCTTCCGCGGCACCTCCAGGCTCTTCCTGTGCAACCCCGTCGCCCGGAGCTTCCTGGAGCTCCCCGCCATCACGTACAAGTGGCCGCCGTCCGTCTCCGTGCACATCCTCGTGGAGAGCAGCGCCTTCAAAGTCATCATCGTGGGGAAGATCCGCCACAACTTCGTCACCGACTCCTTCCGCAGCATCGCCATCTACGAGTCCGTCACCAAGGCCTGGCGCGTCGTGGACGCGCCGCATCCCGCGAAGGTATTCTCCTACGGTCCCACTGCAGCCGTCTGCGGCAACTCCATCTACTGTGAGGCGATTTGCCATTGCGGCCAGCTGGGTGTGATGGCCTACGACGTCCAGTCCGAGACGTGGAACCCGGTGTTGCATGAGATTCCGAGTGATGAACGCGGCGAGTATCAGCTGACGCAAGTTGTG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:CGCCTTCAAAGTCATCATCG反向引物:GGCAAATCGCCTCACAGTAG>序列15齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis18s核糖体RNA(18S)核苷酸序列TTACTATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCTTTGAGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGACTTTGGGTTGGGTCGGCCGGTCCGCCTCTGGTGTGCACCGGTCGTCTCGTCCCTTCTGCCGGCGATACGCTCCTGGTCTTAACTGGCCGGGTCGTGCCTCCGGCGCTGTTACTTTGAAGAAATTAGAGTGCTCAAAGCAAGCCTACGCTCTGGATACATTAGCATGGGATAACATCATAGGATTTCGGTCCA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GGAGAGGGAGCCTGAGA反向引物:CACCAGACTTGCCCTCCAA;b、分别选取干旱,高盐,冷,热,干热混合,脱落酸,氧化,机械损伤,重金属,紫外胁迫共10种非生物胁迫及无胁迫处理,总共11齿肋赤藓配子体样本为实验材料,进行荧光定量PCR模板实验;c、将实时荧光定量PCR得到的数据导入两个最常用的内参稳定性评价软件geNorm,NormFinder和一个内参稳定性综合评价软件Refinder进行内参稳定性和内参数目分析,筛选出最优内参分子和内参分子组合。步骤a中所述的内参基因为18s核糖体RNA,肌动蛋白,α微管蛋白1,α微管蛋白2,β微管蛋白,甘油醛-3-磷酸脱氢酶1,甘油醛-3-磷酸脱氢酶2,泛素蛋白连接酶1,泛素蛋白连接酶2,钙依赖型蛋白激酶,F-盒蛋白,转录延伸因子,肌动蛋白相关蛋白,SAND蛋白,组蛋白3。步骤b中总共11齿肋赤藓配子体为完全复水24h后的经各种胁迫处理后的去除假根的叶片组织。步骤b中非生物胁迫处理的条件为:分别用20%聚乙二醇6000,250mM氯化钠,100μM脱落酸,0.5mM硫酸铜,50mM双氧水,0.5w/m²紫外辐射模拟干旱,高盐,脱落酸,重金属,氧化和紫外胁迫;将齿肋赤藓分别置于温度4°C冰箱和温度42°C光照培养箱模拟低温和高温胁迫;用10%PEG+温度42°C模拟干热混合胁迫,机械损伤胁迫是通过剪断叶片实现;所有处理均是在胁迫6h后取材,且取得的材料立即置于液氮中,并迅速置于温度-80°C冰箱储存。步骤b中实时荧光定量PCR模板均为1μgxa0RNA反转得到的cDNA的5倍稀释液,且荧光定量程序为:第一步是预变性:温度95°C-30秒;第二步是PCR反应阶段,温度95°C-5秒,温度58°C-60°C,30秒,40个循环,收集荧光信号;第三步是溶解曲线分析,温度65°C-95°C,温度65°C在30秒逐步升至95°C,每0.5°C收集一次荧光信号。本发明所述的沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,该方法中所述15个基因的序列设计适合荧光定量实验的PCR引物,用Primer-BLAST和本地blastn同时搜索引物的特异性,并用实时荧光定量PCR生成的溶解曲线和PCR产物电泳来判断引物的特异性,并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等。各个内参基因荧光定量引物信息见表1:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="592"/>本发明所述的沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法,该方法的特点为:针对天然抗旱珍稀荒漠藓类齿肋赤藓基因定量研究中内参基因的参考序列信息缺乏和最稳定、最合适内参分子的筛选工作的空白,选择了12个常用的经典内参分子基因和3个新内参分子基因为候选内参基因,并以这些序列为基础设计特异的实时荧光定量PCR的引物。用实时荧光定量PCR实验检验这15个基因在10种非生物胁迫下的表达稳定性。然后用三大内参分析软件分析实时荧光定量PCR数据,得出了齿肋赤藓在非生物胁迫下下最稳定的内参基因和最优的内参基因组合是CDPK和α-tub2。运用本发明筛选的内参分子,可避免不同非生物胁迫下的齿肋赤藓材料在RNA质量,产量及反转录效率等上的可能存在的误差,能更好的对实时荧光定量检测的数据进行校正和标准化,提高了研究的准确性和可靠性。
附图说明
图1为本发明15个候选内参分子的溶解曲线图。图2为本发明的15个内参基因实时荧光定量产物的电泳图。图3为10非生物胁迫下不同内参基因的实时荧光定量PCR得到的Cq值图,其中■为Cq平均值,I为最大值和最小值。图4为geNorm软件分析的最优内参分子排序图,其中←为最不稳定的内参,→为最稳定的内参。图5为geNorm软件分析的最优内参数目和最合适内参分子组合结果图。图6为NormFinde软件分析的内参分子稳定性排序图。其中←为最不稳定的内参,→为最稳定的内参。图7为Refinder软件分析的内参分子稳定性综合排序图。其中←为最不稳定的内参,→为最稳定的内参。
具体实施方式
下列实施例中,按常规实验操作进行,如《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G塞德曼主编,马学军,舒跃龙译,北京:科学出版社,2004)中所述的方法进行;内参分子的选定:研究和筛选特定植物中最稳定的内参分子和最合适的内参数目(或者说最优的内参组合)是进行荧光定量PCR实验的先决条件。目前,文献中用来作为植物基因表达分析的内参主要有18SrRNA,Actin,GAPDH等这些以前文献报道的经典持家基因。现在越来越多的报道证明,传统经典持家基因不如想象的那么稳定,因此许多对新内参基因的尝试工作陆续展开,如Libault等均报道的CDPK,F-BOX等新内参基因的稳定性在大豆测试的实验条件下均优于传统经典内参基因。因此,本发明主要以模式植物拟南芥和模式苔藓小立碗藓中常用的经典内参基因(如ACT,GAPDH,UBR)为参考,同时也挑选几个在拟南芥和大豆中证明稳定性优于传统内参的新内参基因(如CDPK,F-BOX,SAND),从已有的齿肋赤藓转录组数据库中挑选15个上述拟南芥等内参基因在齿肋赤藓中的同源基因作为候选内参基因,设计各内参基因实时荧光定量特异引物。以从古尔班通古特沙漠采回的齿肋赤藓配子体为实验材料,对采回的干燥的齿肋赤藓配子体材料进行完全复水24h后,进行各种胁迫处理,收集胁迫处理6h后的材料,提取RNA,反转cDNA,进行荧光定量实验来验证内参各个引物的特异性;实时荧光定量内参引物的设计:以15个内参基因序列为基础,设计15对实时荧光定量PCR的基因特异引物,用相似性分析工具BLAST搜索引物在齿肋赤藓转录组库里的特异性,并用实时荧光定量PCR的溶解曲线和产物电泳来进一步验证各引物的特异性;图1为15个基因的溶解曲线图,由图可知,各内参基因引物的溶解曲线均为单峰,无引物二聚体和非特异扩增,各个内参基因的RT-PCT产物电泳图也证实15个内参基因扩增均为单一特异条带,且条带大小与预期一致。上述均证明,15个内参基因的引物均是特异的,可用于接下来的荧光定量实验;植物胁迫处理材料的收集:选取复水24h的齿肋赤藓配子体实验材料,分别用20%聚乙二醇6000,250mM氯化钠,100μM脱落酸,0.5mM硫酸铜,50mM双氧水,0.5w/m²紫外辐射来模拟干旱,高盐,脱落酸,重金属,氧化和紫外胁迫;将齿肋赤藓分别置于温度4°C冰箱和温度42°C光照培养箱来模拟低温和高温胁迫;用10%聚乙二醇6000+温度42°C来模拟干热混合胁迫;机械损伤胁迫是通过剪断叶片来实现;所有处理均是在胁迫6h后取材,且取得的材料要立即置于液氮中,并迅速置于温度-80°C冰箱储存;RNA的提取和反转录:收集各样本的RNA提取用TAKARA的RNAisoxa0reagent试剂,所有样本均用1μgxa0RNA进行反转录;实时荧光定量PCR实验:以上述反转的各胁迫条件下的cDNA的5倍稀释液为模板,用各荧光定量特异引物进行实时荧光定量PCR反应;geNorm,NormFinder和ReFinder软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析:GeNorm软件是根据某一内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值经对数变换后,计算出其平均标准差作为基因表达稳定性的平均值M(M值以1.5为临界点,大于1.5认为不适合做内参,M值越小越稳定),然后对所有内参的表达稳定性进行排序,并对标准化因子进行配对差异分析(配对变异系数Vn/Vn+1)来判断所需内参基因的最适数目(V的临界点一般默认为0.15),经geNorm筛选方法得到的筛选结果:最稳定的两个内参分子是钙依赖型蛋白激酶(CDPK)和α微管蛋白2(α-tub2)(图4),最不稳定的是18s核糖体RNA(18S),各个内参分子的稳定性排序如下:钙依赖型蛋白激酶(CDPK)/α微管蛋白2(α-tub2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白(ACT)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>β微管蛋白(β-tub)>α微管蛋白1(α-tub1)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>组蛋白3(HIS3)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>F-盒蛋白(F-BOX)>转录延伸因子(SPT)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S),且V2/3=0.139<0.15,说明所需内参基因的合适数目是2个,分别是表达相对最稳定的钙依赖型蛋白激酶(CDPK)和α微管蛋白2(α-tub2)(图5);NormFinder是根据内参基因在组间和组内的变异来确定内参稳定性。用稳定系数(stabilityxa0value)来评判内参基因的稳定性(一般以0.5为临界值),该稳定系数越小,表明该内参基因越稳定。与geNorm预测结果一致,经NormFinder分析后,最稳定的内参基因仍然是α-tub2,其次是CDPK,最不稳定的是18S(图6)。具体的稳定性排序为:α微管蛋白2(α-tub2)>钙依赖型蛋白激酶(CDPK)>β微管蛋白(β-tub)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白(ACT)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>α微管蛋白1(α-tub1)>组蛋白3(HIS3)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>转录延伸因子(SPT)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>F-盒蛋白(F-BOX)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S);Refinder软件是一个综合分析评定内参稳定性的在线软件(http://www.leonxie.com/referencegene.php),它整合了以上geNorm,NormFinder等不同软件的算法,对内参的稳定性进行综合分析和排序。根据每个算法得到的排序,Refinder计算每个基因的合适权重(appropriatexa0weight),然后通过计算各个权重的几何平均数来确定每个基因的最终稳定性排序。经Refinder综合排序结果如下:α微管蛋白2(α-tub2)>钙依赖型蛋白激酶(CDPK)>β微管蛋白(β-tub)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白(ACT)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>α微管蛋白1(α-tub1)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>组蛋白3(HIS3)>F-盒蛋白(F-BOX)>转录延伸因子(SPT)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S),综合稳定性排序结果与geNorm和NormFinder很相似。下面通过实验方法来说明本发明的具体筛选过程:实验操作过程:候选内参基因的获得:以齿肋赤藓转录组数据库为基础,挑选15个内参候选基因,所有候选内参基因序列来自本试验室测序获得的齿肋赤藓配子体转录组。15个内参基因序列的比对分析:将各个基因序列提交NCBI里的BLASTX进行比对分析,齿肋赤藓中的各个内参基因序列与模式藓类小立碗藓的同源基因的序列一致性均在58%以上,大部分均在90%以上。与模式植物拟南芥的序列一致性在28%以上,大部分也在90%以上。比对结果见表2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实时荧光定量PCR引物设计和验证:以这些基因序列为基础,用Primerxa0Premier5.0软件设计荧光定量特异引物,用Primer-BLAST软件搜索引物的特异性,并用实时荧光定量PCR生成的溶解曲线和PCR产物电泳来判断引物的特异性,并做标准曲线来判断该内参基因的扩增效率等。以完全复水24h的齿肋赤藓材料,各种胁迫处理6h后取材(齿肋赤藓配子体去掉假根),提取RNA,反转录成cDNA,以上述15个基因的序列设计适合荧光定量实验的PCR引物进行实时荧光定量实验。标准曲线的制作均是以未受胁迫的齿肋赤藓1μg的RNA反转得到的cDNA经梯度稀释后为模板做荧光定量PCR得到的,包括10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³.10²六个模板梯度,各个内参基因荧光定量引物及序列信息参见表1:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="661"/>如表1各内参实时荧光定量的片段大小均在100-300bp左右,且Tm值都很接近,各内参基因的扩增曲线,标准曲线均很好,如18SrRNA基因的扩增效率(E)达到了99.1,相关系数(R²)等于1,表明18S该内参的扩增效率很高,标准曲线的线性关系很好。各内参基因的荧光定量PCR标准曲线,溶解曲线分析(图1)和产物电泳图(图2)所示各内参基因均无非特异条带,特异性很好。以上数据均证明了设计的内参小片段引物等均符合要求,可继续下游的荧光定量实验。实时荧光定量PCR实验:以10种非生物胁迫(干旱,高盐,冷,热,干热混合,脱落酸,重金属,紫外,氧化胁迫和机械损伤)下的齿肋赤藓为实验材料,提RNA,RNA质检(包括琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测)和反转录,反转录采用的是TAKARA的Primescript反转录试剂盒。具体反应体系和程序如下:反转录反应:5×Primescriptxa0Buffer:4μlPrimerscript反转录酶混合液:1μlOligoxa0dT和randomxa0sixxa0mers引物(50μM):1μl总RNA:1μg去RNA酶的水:upxa0to20μl反转录反应条件:温度37°C,时间30min;温度85°C,时间5s。用各内参基因的荧光定量引物扩增各个胁迫条件下cDNA:荧光定量的仪器为Bio-radxa0CFX96.,实时荧光定量PCR采用的是TAKARA的SYBRxa0Premixxa0Exxa0Taq^TM,反应体系如下:SYBRxa0Premixxa0Exxa0TaqII(2x):2μlPCR正向引物(10μM):0.4μlPCR反向引物(10μM):0.4μlcDNA溶液:2μl水:12.2μl总体积:20μl反应程序为:第一步:预变性;循环数1,温度95°C,时间30秒;第二步:PCR反应;循环数40,变性:温度95°C,时间5秒;退火:温度58-60°C,时间30秒第三步:溶解曲线制作;温度65°C-95°C(30s逐步升至95°C),每0.5°C收集一次荧光信号,实时荧光定量PCR得到的所有内参基因的Cq平均值见表3和图3:表3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>如表3图3所示,15个内参基因在10种非生物胁迫和对照共11种实验条件下的相对表达量差异较大。在所有内参中,18S表达丰度最高(Cq值偏小),ARP和UBR1基因表达丰度很低(Cq值偏大)。其他内参的Cq均在20-28之间,符合定量研究中内参最合适的Cq值范围的要求。geNorm软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析:数据分析采用Excel2003和geNorm程序进行,从http://medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/网址下载geNorm程序,用geNorm软件进行内参稳定性和内参数目分析时,其步骤和标准如下:GeNorm对内参基因进行稳定性评价依据的原则是两个理想内参基因表达水平的比值应该在所有标本中一致,不论在何种实验条件或者细胞类型。该方法不受基因间表达丰度差别和极端比值的影响,比值变异度的增加意味着二者中其一或全部基因表达稳定性的降低。、;通过计算某一基因与其他所有基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价指标:首先将荧光定量PCR得到的循环阈值(Cq)转换为相对定量数据,方法是找到最低Cq值的基因(表达量最高),用所有其他基因的Cq值减去最低Cq值,得到△Cq,其值≥0,每个基因相对于最高表达水平基因的相对表达量为2^-△Cq。然后制作Excel表格,列标题为标本名称,行标题为基因名称,将计算得到的各标本各个基因的2^-△Cq数值输入表格。将该文件保存到geNorm安装文件夹下,关闭所有Excel程序。启动geNorm程序,根据操作说明点击自动分析按钮,程序自动给出M值折线图,该图显示了逐步去除最不稳定表达的内参基因过程中每一步骤各内参基因平均表达稳定性数值,M值越小,基因表达越稳定,该图对各管家基因稳定性进行了排序。再次点击自动分析按钮,将给出配对变异分析Vn/n+1结果图,该图显示了需要选择内参基因的数目,建议V<0.15为选择阈值,如V<0.15,表明只需选择2个内参基因作标准化指标。利用该程序研究者可以对特定研究的多个管家基因进行筛选,选出2个以上管家基因作为内参,有助于校正系统偏差以得到更可靠的结果,这对于基因的准确定量,尤其是细小表达差异的基因表达研究具有极其重要的价值。在本发明中,geNorm程序首先通过计算表达稳定度平均值(M)实现了15个看家基因表达稳定度的排序,结果显示最稳定的内参是CDPK和α-TUB2,最不稳定的是18S基因(图4),各个内参分子的稳定性排序如下:钙依赖型蛋白激酶(CDPK)/α微管蛋白2(α-tub2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白(ACT)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>β微管蛋白(β-tub)>α微管蛋白1(α-tub1)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>组蛋白3(HIS3)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>F-盒蛋白(F-BOX)>转录延伸因子(SPT)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S),然后geNorm又计算出配对变异系数V,结果得到V2/3=0.139,<0.15(图5),因此,对于齿肋赤藓配子体在非生物胁迫实验条件下的定量研究,只需要用两个内参来共同校正和标准化就能得到准确的定量结果。这两个内参分别是最稳定的钙依赖型蛋白激酶(CDPK)和α微管蛋白2(α-tub2);NormFinder软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析:NormFinder是根据内参基因在组间和组内的变异来确定内参稳定性,用稳定系数来评判内参基因的稳定性,该稳定系数越小,表明该内参基因越稳定。NormFinder的数据转换与geNorm相同,即首先将荧光定量PCR得到的循环阈值Cq)转换为相对定量数据,方法是找到最低Cq值的基因(表达量最高),用所有其他基因的Cq值减去最低Cq值,得到△Cq,其值≥0,每个基因相对于最高表达水平基因的相对表达量为2^-△Cq。然后制作Excel表格,与geNorm算法不同的是,NormFinder软件数据导入的行标题为样品名称,列标题为基因名称,将计算得到的各样本各个基因的2^-△Cq数值输入表格。将相对定量数据导入NormFinder软件进行内参稳定性分析。在本发明中,NormFinder分析的内参稳定性结果见图6,与geNorm预测结果一致,经NormFinder分析后,最稳定的内参基因仍然是α微管蛋白2(α-tub2),其次是钙依赖型蛋白激酶(CDPK),最不稳定的是18s核糖体RNA(18S)(图6)。具体的稳定性排序为:α微管蛋白2(α-tub2)>钙依赖型蛋白激酶(CDPK)>β微管蛋白(β-tub)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白(ACT)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>α微管蛋白1(α-tub1)>组蛋白3(HIS3)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>转录延伸因子(SPT)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>F-盒蛋白(F-BOX)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S);Refinder软件进行候选内参分子的实时荧光定量PCR数据分析:Refinder软件是一个综合分析评定内参稳定性的在线软件(http://www.leonxie.com/referencegene.php),它整合了以上geNorm,NormFinder等不同软件的算法,对内参的稳定性进行综合分析和排序。根据每个算法得到的排序,Refinder计算每个基因的合适权重(appropriatexa0weight),然后通过计算各个权重的几何平均数来确定每个基因的最终稳定性排序。经Refinder综合排序结果如下:α微管蛋白2(α-tub2)>钙依赖型蛋白激酶(CDPK)>β微管蛋白(β-tub)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2)>SAND蛋白(SAND)>肌动蛋白相关蛋白(ARP)>α微管蛋白1(α-tub1)>泛素蛋白连接酶2(UBR2)>甘油醛-3-磷酸脱氢酶1(GAPDH1)>组蛋白3(HIS3)>F-盒蛋白(F-BOX)>转录延伸因子(SPT)>泛素蛋白连接酶1(UBR1)>18s核糖体RNA(18S)(图7)。Refinder给出的综合稳定性排序结果与geNorm和NormFinder很相似。且最稳定的两个内参也是α微管蛋白2(α-tub2)和钙依赖型蛋白激酶(CDPK),最不稳定的是18s核糖体RNA(18S);对三大软件的稳定性排序综合整理见表4:(表4)ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="681"/>从表4结果表明:虽然三个软件的算法不同,但是得到的内参稳定性排序非常一致,也说明了本实验结果的可靠性,即钙依赖型蛋白激酶(CDPK)和α微管蛋白2(α-tub2)是最稳定的两个,其次是β微管蛋白(β-tub),肌动蛋白(ACT)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶2(GAPDH2),而最不稳定的一直是18s核糖体RNA(18S),泛素蛋白连接酶1(UBR1),转录延伸因子(SPT),肌动蛋白相关蛋白(ARP)和F-盒蛋白(F-BOX),其它基因的稳定性居中。发明名称:沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所15个内参基因的核苷酸序列及设计的15对实时荧光定量PCR引物序列为:>序列1xa0齿肋赤藓SyntrichiacaninervisActinxa0xa0(ACT)xa0核苷酸序列ATGGCTGATGCTGAGGATGTCCAGCCTTTGGTGTGCGACAATGGATCGGGGATGGTTAAGGCCGGATTCGCCGGAGATGACGCCCCGCGTGCCGTATTTCCCAGCATTGTTGGGCGCCCGAGACACACCGGTGTGATGGTGGGCATGGGACAGAAAGACGCGTATGTGGGCGACGAGGCGCAGTCCAAGAGGGGTATCCTGACGCTGAAGTACCCGATCGAGCACGGCGTGGTCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGCGTGTGGCCCCCGAGGAGCACCCGGTGCTGCTCACGGAGGCGCCTCTCAATCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACGCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACGTGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCGGTGCTGTCGCTGTACGCCAGTGGGCGAACCACCGGAATTGTGCTGGATAGTGGAGACGGTGTGACTCACACAGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCTTGCCTCACGCCATTCTGCGGCTGGACTTGGCCGGTCGCGACTTGACGGACGCGCTGATGAAGATTCTGACGGAGCGTGGTTACTCGTTCACCACCACGGCCGAGCGCGAGATCGTGCGTGACATGAAGGAGAAGCTGGCGTACGTGGCAATCGACTTTGAGCAGGAGCTCGACACAGCGCGCTCATCGTCCTCGCTGGAGAAGAGCTACGAGCTGCCGGACGGGCAGGTGATCACGATCGGCGCGGAGCGGTTCAGGTGCCCGGAGGTGCTGTTCAACCCGTCGCTGATCGGGATGGAAGCTGCGGGCATTCACGAGACCACTTACAACTCGATCATGAAGTGTGACGTCGATATCCGTAAAGACCTGTACGGAAACATCGTGTTGTCTGGAGGATCGACCATGTTCCCGGGCATCGCCGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCGCCCAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCGCCGCCGGAGAGGAAGTACAGTGTCTGGATCGGAGGATCCATCTTGGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTGCGAAGAGCGAGTACGATGAGTCCGGTCCATCGATTGTGCACAGGAAGTGCTTT实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:TCGTGTTGTCTGGAGGATCG反向引物:TACTCGCTCTTCGCAATCCAxa0>序列2xa0齿肋赤藓Syntrichiacaninervis肌动蛋白相关蛋白(ARP)xa0核苷酸序列GTGAGCCATGAGTTGAAACTAATAAATTGGAAAGAAAAACAAGCTCAGAAAATGAGCGTACATCGTTGAGACGGTCAGACGAACCATTATCTACGGACATGCGTATTGCGTTGTTCAGGAATGTTCTTTGCGTGGAACTCGGTGTCGGTAACTGGAAGATGTTGACGCAGTTGCTGCTGTTACCTTGCTGACCAAGTTTAGTCCAACATGGCATTGTACCAAAAAGCTTGCGCCTGGAGGGTGTTGGAGTCCCTGTACTTTCGGCCGCTGCCCACCATGACCATACCGTCCAACCAGTCCTCGTACTGCACCCATGAGTCGCGTCCGAAGTCCAAGACGGCGAGAACCGCGCCACCTTTCCACATGATATTCATTGGAGCCATTCGATTTTGAAGAACCTCCACAGTGTCCACAGCTTCGTCCACAGGTATGGCGTGCAGAACCCTCTCCTCAACAGCATCAACCAGGCCTTTCGTTAACCCAACGCCGCCAACCAGCTGAATACTCGCGAACAGCTTCTTCTGAAGATCCACGCGACCTAACGACAGGATACTTTTCACAATAGCTTGTGCAAGGCCACTTGAAGCTTCTTCCACCTCTTTCTTCCCTTTATCTTCAAAGTCGTACGGATCGGAATCATTGTTAATAGAGTTTCCATTAACACTTCCGTTGGTTCCTCCTGTTTCATTTGTCTCAATACGTCGGACAGCTTCAGAAAATGAATCTTCCGCAGTATCTTCATAATCTACGTGATACCAGGGTCGAGGAAGAATCGAATACTCTTCCAGTGCAAGTAGCGAAGGGTAAAATAGTCCCATGGGTGGAATGTTGATGGAAGATAATACGACTGTATATACTCGAGTTGGCTCGCCTGCCATGCGGCACTTGATATCAACCGTCGTGTGTTGCTCACCTTCCAGAAGCACGCAGTGGGTCTCCTTCAGTTTCTCAAGAGTCAAAAAGTCCAACGGATCACGCAAAGGATCAGTATCAGCCAGGGGCCATGTCTTCTTTCGTTGTTGGACCCATAACAAACACCTAGTGATGTCATCTCCACCATACGGCAGCAGAAAACGTGTTGATGGAATAGCAACCCCTTCCTCAACACACATGCCTGAGATAACTTGTGCACCCATGTTTACGATACATCCAGATGAAAAGCCATTCCCAAATGTAGCCGCAACGCATTCCTGGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCAAGTAGCGAAGGGTAAA反向引物:TGCCGTATGGTGGAGATGxa0>序列3xa0齿肋赤藓Syntrichiacaninervis转录延伸因子(SPT)xa0核苷酸序列TTGAAGGTCTTTCTGATATAATCTTCCTTCTTTAAGCGAGTCTTTTCCTGCTCGTTGAGTAAGAAGGTGATGTCGGATTTAAAACGCTTGTCCCGGTGCTGCGTATCATCCCTAGACTCTTCCCGCATATCGCTTTCCTTGCATGTCAAATCGACCAAGTACTTATCCTTTTTCACCTCTTTCACTCGGCAAGTCACTGAAGTGCCTTCTGAAAATTTATCTTTAAGTTCAACATCGCCGTCATCTGAAACATCTTCCTTCTGAATGAAACCCAGTAATCCACATTCCAATACACACATGAGCTGATGTTCCTGCACTCTTCTTATTGTTGCTTGTACAATTCCACCTTCAAAGAGTGTCTCTTTGCTCTCCCCGGTCATGAGATAGAAACACTCTTCTTGAGACGGCTCCGAGTACGACCTCCGCCATTCTTGAAATCCTCGCTGCAGCTCAGATTTGATCAACTCCAGTGTCTTCAATCCCCGGCCTTCAACGTGTGCAGATTGGGCATACTCCGCAATGTCTACAGAATCTAAAGCGTTGGGATTTTTAATCACACGATCTACTGCCATACTTGGCACATCATCGTCCACTTCTTCGTTATTCCGCATGCCTTCCTTCTCGATCGCAGCTTCAGCTAGGTTCTTTGCCATCTGATACAACTCAGGGTGAATACGGGTGTTGTCTAAAAGCTCTGTAGGACGTAAATCTGAAGGTGTTTCTCCAATTTCACGCACTCGGATGAAACCAGCGGAATTTGTGAAGACTTTCTCATTCACAGCCCGTATGGTCGAGTAAAGACTATCTCGAGTCAATACACGCTTTACCACTTGAAGATTTGTCCGAAACTCACAAGCCTTCAGAGGGCCAAGACCCGCAACGAACTGAAGGGTCTCAAACAACCAGTCGTGGATAATAGCTAGA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:ACTTGGCACATCATCGTCC反向引物:ATTCCGCTGGTTTCATCCxa0>序列4xa0齿肋赤藓Syntrichiacaninervis钙依赖型蛋白激酶(CDPK)xa0核苷酸序列TGAGATGTTTAAACACTACCTCAATTACATGCTGAAATCCAATACATTTGACGTAGAAGCATCAACAGTGTTTGGCACCTAATCATTTCCTCTCGGGCGCCTCTAGCGATGGCACTGAAAATGATACACGGGGACTAAAGGCCATGGCCCTAGAGCAAGTAACATGACAAACTTTACATATTCAAACTCCCCATGGTAAGGAGAGAGTGCTACTCGCCTCTGTAGAAGTGACTGGTTCGCACAGCCATGTTGAGGTGCCTACTTCCTGCTGAACTCGGTGTGAACCCTATCCTCCGATCCCCAACGCGTCGGTCAGATTCAACTGCTGGCTGTTGCGTAGCGATGAGCGACCAGCACCGCCCTTGTTGCCCTTGCGCATCATGTTGACGAACTCGGTGTAATCAATCTGGCCATCGTTGTTCTGGTCGACCTCCCTGAGCAGCTCCTCCACGGATACGTCTCCCATGTTGAATTCGGCCAACGCATGTTGCAGCTCATCGACCGTCAGATAGCCGCTGTTGTCCTTGTCTAGGTACGAGAAGGCGGCGAACATGTTCTCATCGCGTTCGACCTTGTTCAGGTGGAGAGTGGCGGCCAGAAACTCGCCATAATCGATTGCCCCACTGCCGTCGACGTCAGCGGCGTCCATGAGCTGCCGAACGTCTTCCTCTTTGAGATTGGAACCCACTTTCTTCAGACCCGCCTTCAGCTCCTCGTAGCTGATGGACCCTGAGTTGTCCGTGTCCATCATCTTGAACATCTCCTTCAGACCTGCGATCTCCTCCTCCGACAAGGACTCCGCGATCACCCGGATGGCGATCTTCTTCAGCTTGTTCATTGCGGAGAAGTGCTTGAGCCGGGATTGCACTGCGGAATCGATGGGTCTGTCGGGCGCTACTCCGTCCTCGCAGATCCAAGGATGTGCCAACACTTGATGGGCTTTCAACCTCTTCGAAGCCTGGGGCGTGAGCATTTTGCGGATCAAATCCTTGGCGCTATCAGAAATCTTAGGCCATGGATCTGATGC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CGCGCTCTGCAACCTCGTCAGCTACCTGGACGGCAACAAGAAGCGCGCGGTGGACGCCGGCCTCACACCCCTCCTCATGGCGGTTCTGCGCGAC实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCAGGGAGGCATACCTTTCTT反向引物:ATGAGCCCTCTGTTGTTTGGAxa0>序列9xa0齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis泛素蛋白连接酶2xa0(UBR2)核苷酸序列ATGGGGTTAGGGTATGGGCCAGTGGTGGCATTGTACACGGCGTTGAGTGTGGGTGGGATAGCATGGAAGCTCAACTCAGCGTGGTGGACTATGACCTACGGCAAGGGTCAAGGAGGTGGTGGGCAGATGGATCCCTCCGAAGCGGCGCGCACGCTGCAGGCCATGCTGCAATCATCCGTCGTGGTGGCGCTCCTCGTCAACCTTCTCGTCAACTTTTTCCTTCTCGTCACCCTCTCAATGAAGACTGTGTTCTTCGGTCAGTTGTCTCTGGTTGAGACTCAGAAGGTGGTGGAGCGCCTCATCAATTATGTATTATTCAAGGGCCTGTTCTTGACATGGGTCGTGAGGCCAGAAATGATGCAGATAGCTGTGTGGTTGGCGTGGTTCTCCGTCTTGGGCTTTCTGAAGATGTTCCAAGGTTTGGCAAGAGATCGTTTGGAGCGCTTAAATGCATCTCCTTCTGCGACAATGTTGGCTCACATAAGAGTTTATACGGTTCTCTTGTTCGTTCTTCTGTTCGATTTGCTCTGGATGCAGCTGTGTCTGCTTTTATTCAAAGACACTGGAACCAGTACCTTCTTGCTACTTTTGTTTGAGCCTCTCAGTATAGCATTTGACACTCTTCAGGCAGTAATTGTACACGGTATGCAGCTATTGGACACTTGGCAGCGGCAAAACCTTGATATTTCTGCACACGATATAAGTTTGCAGCCTTCTGAGAGGTCTGCTGCAGGTGCAGCTTGGGAGTGGCGTGGAACTGTTGTAAGAAATTGCAGCTTTGTGATGGATATTGTGAGCTTGTTACTGGCTTTGGGCCATTGCGTACACATCTGGTGGTTACGTGGGCTTGCTTTTCAAGTGGTGGATGCCATTCTTTTCCTCAACTTGCGCGCGCTATTGAGTGCTATTTCAAAAAGAATAAAAGGTTTCATGCGTCTTCGGGCAGCCATGACAACTCTGCAGGGTGCGCTTCCCGATGCAACGCAGGATGAACTCCTTGGATATGAAGATGATTGTGCCATTTGCAAGGAGCCCATGGCTAGGGCAAAACGGCTTCCTTGTGCTCATCTCTTCCATCTCGCGTGCTTGAGATCCTGGCTAGACCAAGGATTAGCAGACACATACTCTTGCCCGACCTGCCGTAGACCCCTCTTCATGGGCGGGTTCCGGACTGCAACAAACAATTTGCAGCGCCTGGTAGATGTGCCCACTGCATCCCCCGGCACAAATGAAACTCAGGCACAGGTTGCACAACGACAAGACTTAGCTGCAGCGCCGTCTCCACCTCTCACCACCTTGACTCCCGCTCCAGCACCG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AGCTTGTTACTGGCTTTGGG反向引物:GGAGTTCATCCTGCGTTGCxa0>序列10xa0齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶1xa0(GAPDH1)xa0核苷酸序列TCCGGGATCAAGAACACCAATGCCGTCACCTTCGGCAAGCGCACTGATGACCTCGTCAGCGTTGTTGCTGCCCAGTCTGCTGTGTCTGCTAGCTCCGGAGCCACGAGGGCCGTGACCGAGGCCAAGATCAGGGTTGCCATTAACGGTTTTGGGCGTATTGGACGCAACTTCGTCCGCTGCTGGCATGGAAGGAAGGACTCGCCTCTCGAGGTCGTCGTGATCAACGACACCGGAGGCGTGAAGCAGGCTTCTCACCTGTTGAAGTACGACTCCATGCTCGGCACCTTCAATGCCGACGTGAAGGTCGACGGTGATGGCATCAGCGTTGATGGCAAGACCATCAAGGTGGTGTCCGACAGGAACCCGCTCAACTTGCCATGGGGGGATATGGACATCGACCTTGTCATTGAGGGGACCGGAGTGTTCGTCGACGAGGCTGGTGCCGGCAAGCACTTGCAGGCGGGAGCGAAGAAGGTGCTCATCACCGCCCCAGGAAAGGGTGCCATCCCCACGTACGTGATCGGAGTAAACGAGCAGGATTACACCCACGCGGACAAGATCATCAGCAACGCGTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCCCCGTTCGTGAAGGTGTTGGACGAGAAGTTCGGCATCATCAAGGGTACCATGACCACCACCCACTCATACACTGGTGACCAGAGGCTGCTGGACGCTTCCCACCGCGACTTGAGGAGAGCCCGTGCCGCGGCCCTGAACATCGTGCCCACCTCCACGGGAGCCGCCAAGGCCGTGGCGCTGGTGCTGCCGAGGCTGAAGGGCAAGATCAACGGAATCGCCCTGCGTGTGCCCACCCCCAACGTGTCCGTGGTGGACTTGGTGGTGCAGGTGGAGAAGAAGACGTTCGCGGAGGAGGTGAACCAGGCGTTCAGGGATGCGTGCGAGACCCCTCAGCTGAAGGGCATTTTGGCAGTGTGCGACGAGCCTTTGGTGTCGGTGGACTTCAGGTGCACTGACGTGTCGTCCACGGTGGACTCGTCCCTGACCATGGTGATGGGCGACGACATGGTGAAGGTTGTGGCATGGTACGACAACGAGTGGGGGTACTCGCAGCGGGTGGTGGACCTGGCTAACTTGGTAGCGGAGAAGTGGCAG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GCGTTGTTGCTGCCCAGTC反向引物:AGGCGAGTCCTTCCTTCCATxa0>序列11xa0齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis甘油醛-3-磷酸脱氢酶2xa0(GAPDH2)xa0核苷酸序列ATCGGAAGACTCGTCCTCCGTGTGATTCTTGCCAGGGACGATGTGGAAGTTGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGACACCAAGTACATGGCATACCTGTTGAAGTACGATTCCACCCACGGGCTTCTCAAGGCTGATGTGCACGCTGTTGATGACAAGACTCTGCAAGTTGCTTCTCAAACCATCAAGGTCTTCGGATGCAGGGATCCCGCGGATATCCCATGGGGTGAAGCCGGTGCTGATTACGTGGTGGAGTCCACCGGTGTTTTCACCGCCGTTGCCGGCGCCTCGGCCCATTTCAAGGGAGGAGCCAAGAAGGTTGTTATTTCCGCACCATCGGGAGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCAGAACGCTTACAAGGATGACATGAACGTCGTCTCCAATGCCAGCTGCACCACCAACTGCCTTGCTCCCCTAGCTAAGGTGATCCAGGACGAGTTCGGCATTCTCGAGGGTCTGATGACCACCGTTCACGCCACTACCGCCACCCAGAAGACCGTCGATGGCCCATCAGGGAAGGACTGGCGTGGAGGACGTGGTGCTGGCCAGAACATCATCCCCAGCTCCACCGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTGTTGCCTGAGCTGAACGGCAAGTTGACCGGCATGGCGTTCCGTGTGCCCACCCCGAACGTTTCAGTGGTGGACTTGACTGTGCGCCTGGAGAAGGGTGGGTCCTACGAGGACGTCAAGGCAGCCATCAAGGCCGCCTCTGAAGGACCGATGCATGGCATCTTGGGCTACACCGAAGACGACGTGGTGTCGAACGACTTCATCGGTGACGCCAGGTCCAGCATCTTCGATGCTAAGGCAGGAATCGCTTTGAACGACAAGTTCGTCAAGTTGGTGTCGTGGTATGACAACGAGTGGGGCTACAGCAACCGTGTGGTGGACCTG实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:GGGCTTCTCAAGGCTGATGT反向引物:TCCACCACGTAATCAGCACCxa0>序列12xa0齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervisSAND蛋白(SAND)xa0核苷酸序列TCGGAAGTGGAAGCTGATAATACAGCGAAACTCTCAAACCTGGACATCAGTAGCAGCACGCAGGAGGACGGTTCAAAGCTTGAAACTCATGATGCAGAAGATGGTCCAAAAGCCTTGGACATGGGAGATGGAGAAGGTACTGCGCTCGCTGCTTCTACAACTACTGATGTTGTGCCGGAGAGTACTGTGGATGGAGATACATTGTCTGAAGATGGCATCCATGAGAGCCCTGTGAGTCCAAGCAGTAGCCGCGAAGGAACCAGTGGCTACTTAGCAGGCAGTGGCAGCAGTACCGCGAGTGTCTATAGCGCAAGTGGAGCAGATGAAAGTGCCGATCGAATTCTGAATCAGGATTCTATGCCACAAGCGACGAGGCGGTCTTGGGTCCCTGGAAAACGCCATCCAGATGAAGATGACACGTCTCTCGCTTGGCGAAAGCACAAGAAGCATTTCTTTATTCTCAGCAATGCAGGAAAACCA实时荧光定量PCR引物序列:正向引物:AAAGCCTTGGACATGGGAGA反向引物:CGTCGCTTGTGGCATAGAAxa0>序列13xa0xa0齿肋赤藓Syntrichiaxa0caninervis组蛋白3xa0(HIS3)核苷酸序列CTAAAGACGGGAGAACGAAGACCCTTTTCTCCTCCTTCGGCTTCACCTCCCCATCTTTCTCTCTCGCTCACTCTCGACATCGTCATCTCTCTCGTATTCTACCTACACCGCCGTTTCATTTCCACAAGTGTCACTATGGCGCGTACGAAGCAGACGGCTCGTAAGTCCACCGGAGGAAAGGCTCCGAGGAAGCAGCTCGCCACGAAGGCTGCGAGGAAGTCGGCCCCCACCACCGGAGGAGTGAAGAAGCCCCATCGCTACAGGCCGGGAACCGTCGCTCTTCGTGAGATCCGCAAGTACCAGAAGAGTACCGAGTTGCTGATCCGCAAGCTGCCCTTCCAGAGGCTGGTTCGTGAGATCGCCCAGGACTTCAAGACCGATCTGCGTTTCCAGAGCCACG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